L’epigenetica è una delle aree in più rapida crescita della ricerca accademica e farmaceutica, con molti progetti incentrati sulla comprensione delle funzioni delle modificazioni post-traduzionali (PTM) degli istoni sulla cromatina. In effetti, manipolare o alterare le proteine che interagiscono con l’istone PTM, come “lettori” e / o enzimi modificanti la cromatina, è una strategia terapeutica attraente.
Tuttavia, i target PTM precisi di molte di queste proteine non sono noti. In particolare, ci sono pochi metodi affidabili disponibili per lo screening delle proteine contro i PTM in un contesto fisiologico e nucleosomico. Questi approcci mancano anche dell’ampia diversità del substrato e della sensibilità del dosaggio necessaria per rilevare l’associazione attraverso una vasta gamma di PTM correlati / comuni.
dCypher®: una nuova piattaforma per interrogare l’associazione ai PTM
EpiCypher ha sviluppato dCypher, una piattaforma di servizi e prodotti che ha in mente esattamente queste esigenze. I nostri servizi dCypher combinano la libreria EpiCypher di nucleosomi di designer ricombinanti modificati (dNucs) con AlphaScreen® (Perkin Elmer®), un test di prossimità senza lavaggio, basato su microsfere.
dCypher® Nucleosome Panels: una diversità senza eguali per la profilatura rapida dell’istone PTM
Abbiamo discusso della piattaforma dCypher di EpiCypher in un precedente post, evidenziandone la funzionalità nel delineare la specificità delle proteine del lettore sul peptide istonico rispetto a dNucs. Come mostrato nella Figura 1, l’interazione dei lettori di cromatina con dNucs porta i granuli AlphaScreen Donor e Acceptor in stretta vicinanza, consentendo l’eccitazione indotta dalla luce del tallone Acceptor, che viene rilasciato sotto forma di fluorescenza. Sebbene qui sia mostrato un dominio del lettore di cromatina, questa piattaforma potrebbe essere utilizzata per schermare qualsiasi numero di proteine che interagiscono con la cromatina, inclusi scrittori, gomme e potenziali farmaci o inibitori.
I nuovi pannelli nucleosomici dCypher® consentono lo screening rapido dei PTM
EpiCypher ha una collezione diversificata di dNuc modificati, che comprende tutti i PTM più comunemente studiati nella ricerca epigenetica. Abbiamo recentemente rilasciato questi dNuc in una serie di pannelli in formato piastra a 96 pozzetti, consentendone l’implementazione per saggi di individuazione ad alto rendimento e di facile utilizzo. Insieme, i nostri pannelli nucleosomici dCypher e i servizi di analisi forniscono agli scienziati un accesso immediato alla diversità nucleosomica di PTM per interrogare la regolazione epigenetica e le malattie associate.
Questi pannelli sono disponibili in quattro versioni uniche, ognuna con un set completo di PTM correlate e varianti di istoni (figure 2 e 3). Tre dei nostri set consentono una ricerca mirata su specifiche famiglie PTM, in particolare metilazione della lisina istone + mutazioni oncogeniche dell’istone (Figura 2A), acilazione della lisina istone (Figura 2B) e metilazione dell’arginina istone (Figura 2C). Per schermi ad alto impatto, offriamo anche un dCypher Nucleosome Full Panel, che contiene 77 nucleosomi unici, tra cui 60 dNuc modificati, 8 onco-mutazioni (oncoNucs), 4 varianti di istone (vNucs) e 2 dNucs di DNA metilato (MeDNA dNucs; Figura 3). I nostri pannelli offrono una diversità senza precedenti per la profilazione delle proteine dell’interattatore della cromatina (ad esempio lettori, enzimi, anticorpi, ecc.) Su substrati nucleosomici fisiologici altamente definiti.
Il contesto nucleosomico altera la specificità di legame del lettore di cromatina
Abbiamo applicato i nostri pannelli nucleosomici dCypher a una varietà di interattori di cromatina, incluso il bromodomo 1 BRD4 (BD-1; Figura 4). È interessante notare che, usando il nostro pannello dCypher Nucleosome K-AcylStat, abbiamo scoperto che BRD4 (BD-1) mostra un’elevata preferenza di legame per il dNuc poli-acetilato H4K5 / 8/12/16, ma poca interazione con dNucs singoli acetilati o altri acil-modificati nel pannello. Questi risultati sono in accordo con le sue preferenze riportate sui peptidi istonici modificati1.
dCypher ha anche rivelato romanzo, specificità limitata per i lettori di cromatina su dNucs, rispetto al legame con istoni modificati. Come dettagliato nel nostro precedente post sul blog, usando dCypher abbiamo scoperto che il cromodomain HP1β si lega solo ai substrati dNuc H3K9me3, ma si lega a tutti e tre i peptidi istone H3K9me1, me2 e me3. Questa è una tendenza ricorrente nel nostro test dCypher e illustra la potenza della piattaforma dCypher nella definizione delle interazioni di legame del lettore di cromatina contro una vasta gamma di substrati peptidici dNuc e istone singoli e modificati in modo combinatorio.
Come accennato in precedenza, i nostri pannelli dCypher Nucleosome possono essere utilizzati come substrati o controlli per una varietà di tipi di test, tra cui AlphaScreen, immunoprecipitazione, immunoblotting, ELISA o applicazioni personalizzate per l’utente (le possibilità sono infinite!). Ogni piastra dCypher viene fornita con un substrato dNuc sufficiente per eseguire> 35 test AlphaScreen,> 30 esperimenti IP-qPCR e 3-5 test di immunoblotting.
