Nonostante la schiacciante popolarità dell’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) nella ricerca sull’epigenetica, i metodi ChIP hanno scarso rendimento, elevato background e bassa precisione / affidabilità. Sebbene la xeno-cromatina esogena della Drosophila sia stata implementata come controllo spike-in per la normalizzazione dei campioni1, 2, questo prodotto naturale è scarsamente definito come reagente, rendendolo altamente variabile tra preparazioni ed esperimenti. Tali standard non sono inoltre in grado di testare la specificità degli anticorpi o di esaminare le variazioni tecniche, lasciando una grande e insoddisfatta necessità di controlli quantitativi negli esperimenti ChIP.
SNAP-ChIP Spike-Ins migliora la qualità del ChIP
I controlli Spike-In SNAP-ChIP® sono essenziali per gli esperimenti ChIP
EpiCypher ha aperto la strada allo sviluppo di nucleosomi di design ricombinanti (dNucs) per applicazioni di cromatina, con un focus iniziale sulla specificità degli anticorpi. I nostri prodotti e servizi SNAP-ChIP® recentemente lanciati utilizzano pannelli di nucleosomi di progettazione modificata con codice a barre DNA (dNucs) come controlli di picco per esperimenti ChIP (Figura 1). Dopo l’immunoprecipitazione, eseguiamo qPCR o sequenziamento di nuova generazione (NGS) per rilevare codici a barre DNA specifici per PTM, che quantifica la quantità di legame anticorpale su e fuori bersaglio3, 4.
Per soddisfare le crescenti esigenze del mercato, EpiCypher ha iniziato a sfruttare la tecnologia SNAP-ChIP per sviluppare gli anticorpi validati SNAP-ChIP migliori della categoria. Inoltre, incoraggiamo i ricercatori a eseguire SNAP-ChIP sui propri anticorpi interni, il che confermerà e fornirà una rinnovata fiducia nei dati risultanti.
Controlli Spike-Ins SNAP-ChIP: richiesti per ogni esperimento?
Sentiamo questa domanda abbastanza spesso dai clienti, che vogliono sapere se hanno bisogno di includere controlli spike-in SNAP nel loro progetto di studio se stanno già usando un anticorpo validato SNAP-ChIP. La risposta breve è sì; ma la spiegazione richiede una dimostrazione più ponderata dei numerosi vantaggi degli spike SNAP-ChIP.
Gli spike-in SNAP-ChIP di EpiCypher, combinati con l’uso di primer e sonde qPCR, sono uno strumento prezioso in diversi aspetti della metodologia ChIP, tra cui:
1) Monitoraggio della variabilità tecnica tra esperimenti / scienziati
2) Valutazione della variazione da lotto a lotto nella specificità dell’anticorpo
Entrambi questi approcci aiuteranno a ottimizzare i tuoi esperimenti ChIP e a migliorare l’affidabilità e l’accuratezza dei tuoi dati.
Strategia STOP / GO per ChIP-seq
Siamo stati tutti lì: hai eseguito il tuo esperimento ChIP-seq con tre (o più) replicati biologici e tutto sembra perfetto … tranne quell’unico campione (Figura 2A). Quel campione sembra drasticamente diverso dal resto. Quello che è successo? Come avrebbe potuto essere evitato?
I controlli Spike-In SNAP-ChIP® sono essenziali per gli esperimenti ChIP
Poiché i pannelli SNAP-ChIP vengono aggiunti prima dell’immunoprecipitazione (IP), possono essere utilizzati per monitorare la variabilità imprevista tra i campioni. Abbiamo sviluppato gli spike SNAP-ChIP in un’utile strategia STOP / GO per ChIP-seq, in cui eseguiamo qPCR per i codici a barre DNA dNuc dopo IP, prima della preparazione della libreria e NGS (Figura 1).
Come mostrato nella Figura 2A vs. 2B, due esperimenti indipendenti con lo stesso anticorpo altamente specifico possono ancora produrre risultati drasticamente diversi, che vanno dal legame non specifico alla ridotta efficienza IP. Usando i nostri primer e sonde qPCR SNAP-ChIP, abbiamo risparmiato molto tempo (e denaro) identificando campioni scarsamente preparati prima di NGS.
La nostra strategia si inserisce in un tipico flusso di lavoro ChIP-seq, in cui gli scienziati confermano le prestazioni ChIP tramite qPCR per loci genomici precedentemente dimostrati arricchiti per il target PTM, rispetto ai controlli negativi (loci non arricchiti). Tuttavia, questo approccio tradizionale non controlla le prestazioni degli anticorpi (ovvero la specificità e l’efficienza degli anticorpi). Inoltre, se gli standard dei loci genomici originali sono stati identificati usando anticorpi cross-reattivi, questo metodo è potenzialmente errato e nella migliore delle ipotesi3. Fornendo un pool altamente validato di nucleosomi ricombinanti che ospitano PTM on e off target, SNAP-ChIP fornisce controlli spike-in definiti positivi e negativi per monitorare con sicurezza il recupero on target dopo ChIP.
Variazione da lotto a lotto nella specificità dell’anticorpo
I controlli Spike-In SNAP-ChIP® sono essenziali per gli esperimenti ChIP
Una volta trovato un anticorpo certificato SNAP-ChIP per il tuo istone PTM preferito, dovresti essere pronto, giusto? Non così in fretta…
Per valutare la coerenza delle prestazioni degli anticorpi, EpiCypher ha testato numerosi lotti di anticorpi ChIP disponibili in commercio. Le prestazioni degli anticorpi (specificità e arricchimento del target) sono state determinate per oltre 200 anticorpi testati finora (vedere Shah et al., 2018 e informarsi per risultati non pubblicati su [email protected]). Qui, mostriamo i risultati SNAP-ChIP per tre diversi lotti di un anticorpo policlonale (Figura 3).
Sfortunatamente, il lotto 3 (Figura 3C) ha mostrato una notevole variazione rispetto ai lotti 1 e 2 (Figure 3A-B), con un significativo legame fuori bersaglio con H3K9ac
