Ingegneria di geni ibridi senza l’uso di enzimi di restrizione: splicing genico per estensione di sovrapposizione.

Osteoprotegerina: una nuova proteina secreta coinvolta nella regolazione della densità ossea.

È stata identificata una nuova glicoproteina secreta che regola il riassorbimento osseo. La proteina, denominata Osteoprotegerina (OPG), è un nuovo membro della superfamiglia del recettore del TNF. In vivo, l’espressione epatica di OPG nei topi transgenici provoca un’osteopetrosi profonda ma non letale, coincidente con una diminuzione negli stadi successivi della differenziazione degli osteoclasti. Questi stessi effetti si osservano dopo la somministrazione di OPG ricombinante in topi normali.

In vitro, la differenziazione degli osteoclasti dalle cellule precursori è bloccata in modo dose-dipendente dall’OPG ricombinante. Inoltre, l’OPG blocca la perdita ossea associata all’ovariectomia nei ratti. Questi dati mostrano che l’OPG può agire come un fattore solubile nella regolazione della massa ossea e implicare un’utilità per l’OPG nel trattamento dell’osteoporosi associata ad una maggiore attività degli osteoclasti.

Attivazione della trascrizione del gene del fattore di crescita endoteliale vascolare da parte del fattore 1 inducibile dall’ipossia.

L’espressione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) è indotta nelle cellule esposte a ipossia o ischemia. La neovascolarizzazione stimolata dal VEGF si verifica in diversi importanti contesti clinici, tra cui l’ischemia miocardica, la malattia della retina e la crescita del tumore. Il fattore 1 inducibile dall’ipossia (HIF-1) è una proteina di base eterodimerica elica-ansa-elica che attiva la trascrizione del gene dell’eritropoietina umana nelle cellule ipossiche. Qui dimostriamo il coinvolgimento di HIF-1 nell’attivazione della trascrizione di VEGF. Le sequenze fiancheggianti del VEGF 5′ hanno mediato l’attivazione trascrizionale dell’espressione del gene reporter nelle cellule Hep3B ipossiche. Una sequenza di 47 bp situata da 985 a 939 bp 5 ‘al sito di inizio della trascrizione del VEGF ha mediato l’espressione genica reporter inducibile dall’ipossia diretta da un elemento promotore del virus scimmiesco 40 che altrimenti era minimamente sensibile all’ipossia.

Quando i reporter contenenti sequenze di VEGF, nel contesto del VEGF nativo o del promotore eterologo del virus scimmiesco 40, sono stati cotrasfettati con vettori di espressione codificanti HIF-1alfa e HIF-1beta (ARNT [traslocatore nucleare del recettore dell’idrocarburo arilico]), la trascrizione del gene reporter era molto maggiore in cellule sia ipossiche che non ipossiche che in cellule trasfettate con il solo reporter.

Un sito di legame HIF-1 è stato dimostrato nell’elemento di risposta all’ipossia di 47 bp e una sostituzione di 3 bp ha eliminato la capacità dell’elemento di legare HIF-1 e di attivare la trascrizione in risposta all’ipossia e / o HIF-1 ricombinante. La cotrasfezione di cellule con un vettore di espressione che codifica per una forma negativa dominante di HIF-1alfa ha inibito l’attivazione della trascrizione reporter nelle cellule ipossiche in modo dose-dipendente. L’mRNA del VEGF non è stato indotto dall’ipossia nelle cellule mutanti che non esprimono la subunità HIF-1beta (ARNT). Questi risultati implicano HIF-1 nell’attivazione della trascrizione del VEGF nelle cellule ipossiche.

Il soppressore tumorale, PTEN/MMAC1, defosforila il secondo messaggero lipidico, il fosfatidilinositolo 3,4,5-trifosfato

Mutagenesi inserzionale in vitro con un frammento di DNA selezionabile.

Viene presentato un nuovo metodo per la mutagenesi inserzionale in vitro di geni clonati in Escherichia coli. Questa semplice procedura combina i vantaggi della mutagenesi del linker del DNA in vitro con quelli della mutagenesi della trasposizione in vivo. Fa uso del frammento omega, un segmento di DNA di 2,0 kb costituito da un gene di resistenza agli antibiotici (il gene Smr / Spcr del plasmide R100.1) affiancato da brevi ripetizioni invertite portanti segnali di terminazione di trascrizione e traduzione e polilinker sintetici.

Il frammento omega viene inserito in un plasmide linearizzato mediante legatura in vitro e le molecole di DNA ricombinante vengono selezionate in base alla loro resistenza alla streptomicina e alla spectinomicina. Il frammento omega termina prematuramente la sintesi di RNA e proteine, consentendo così la definizione e la mappatura delle unità di trascrizione e traduzione.

A causa della struttura simmetrica di omega, lo stesso effetto si ottiene con inserzioni in entrambi gli orientamenti. Il gene della resistenza agli antibiotici può essere successivamente asportato dalle molecole mutate, lasciando dietro di sé i suoi siti di restrizione fiancheggianti.

Sicurezza ed efficacia del trasferimento genico per l’amaurosi congenita di Leber.

L’amaurosi congenita di Leber (LCA) è un gruppo di malattie ereditarie accecanti con esordio durante l’infanzia. Una forma della malattia, LCA2, è causata da mutazioni nel gene della proteina 65-kDa specifico dell’epitelio del pigmento retinico (RPE65). Abbiamo studiato la sicurezza della consegna sottoretinica di un virus adeno-associato ricombinante (AAV) che trasporta il DNA complementare RPE65 (cDNA).

Tre pazienti con LCA2 avevano un profilo di eventi avversi locali e sistemici accettabile dopo la consegna di AAV2.hRPE65v2. Ogni paziente ha avuto un modesto miglioramento nelle misure della funzione retinica sui test soggettivi dell’acuità visiva. In un paziente si è sviluppato un foro maculare asintomatico e, sebbene l’evento sia stato considerato un evento avverso, il paziente ha avuto un certo ritorno della funzione retinica. Sebbene il follow-up sia stato molto breve e la vista normale non sia stata raggiunta, questo studio fornisce la base per ulteriori studi di terapia genica in pazienti con LCA.