Legame del virus dell’epatite C al CD81.

L’infezione da virus dell’epatite C cronica (HCV) si verifica in circa il 3% della popolazione mondiale ed è una delle principali cause di malattie del fegato. L’infezione da HCV è anche associata alla crioglobulinemia, una malattia proliferativa dei linfociti B. Il tropismo virale è controverso e i meccanismi di ingresso delle cellule rimangono sconosciuti.

La proteina E2 dell’involucro dell’HCV si lega al CD81 umano, una tetraspanina espressa su vari tipi cellulari, inclusi epatociti e linfociti B. Il legame di E2 è stato mappato al principale ciclo extracellulare di CD81. Le molecole ricombinanti contenenti questo HCV legato ad anello e gli anticorpi che neutralizzano l’infezione da HCV in vivo hanno inibito il legame del virus con il CD81 in vitro.

Gli estratti proteici derivati dall’osso possono avviare il processo che inizia con la formazione della cartilagine e termina con la formazione ossea de novo. I componenti critici di questo estratto, chiamato proteina morfogenetica ossea (BMP), che dirigono la cartilagine e la formazione ossea, nonché gli elementi costitutivi forniti dall’animale durante questo processo, sono rimasti a lungo poco chiari. La sequenza di amminoacidi è stata derivata da una preparazione altamente purificata di BMP da osso bovino.

Ora, sono stati ottenuti cloni di DNA complementare umano corrispondenti a tre polipeptidi presenti in questa preparazione di BMP ed è stata ottenuta l’espressione delle proteine umane ricombinanti. Ciascuno dei tre (BMP-1, BMP-2A e BMP-3) sembra essere in grado di indurre indipendentemente la formazione di cartilagine in vivo. Due delle proteine codificate (BMP-2A e BMP-3) sono nuovi membri della famiglia del supergene TGF-beta, mentre la terza, BMP-1, sembra essere una nuova molecola regolatrice.

Un sistema di espressione transitoria potenziato nelle piante basato sulla soppressione del silenziamento genico da parte della proteina p19 del virus acrobatico del pomodoro.

L’espressione genica transitoria è un approccio veloce, flessibile e riproducibile all’espressione di alto livello di proteine utili. Nelle piante, i ceppi ricombinanti di Agrobacterium tumefaciens possono essere utilizzati per l’espressione transitoria di geni che sono stati inseriti nella regione T-DNA del plasmide Ti batterico. Una coltura batterica viene infiltrata sotto vuoto nelle foglie e, al trasferimento del T-DNA, si verifica un’espressione ectopica del gene di interesse nelle cellule vegetali. Tuttavia, l’utilità del sistema è limitata perché l’espressione della proteina ectopica cessa dopo 2-3 giorni.

Qui, mostriamo che il silenziamento genico post-trascrizionale (PTGS) è una delle principali cause di questa mancanza di efficienza. Descriviamo un sistema basato sulla co-espressione di un soppressore codificato virale del silenziamento genico, la proteina p19 del virus acrobatico del pomodoro (TBSV), che impedisce l’insorgenza di PTGS nei tessuti infiltrati e consente un alto livello di espressione transitoria. L’espressione di una gamma di proteine è stata migliorata di 50 volte o più in presenza di p19 in modo che la purificazione delle proteine potesse essere ottenuta da un minimo di 100 mg di materiale fogliare infiltrato.

L’effetto di p19 non era saturato nelle cellule che avevano ricevuto fino a quattro singoli T-DNA e persisteva fino alla senescenza fogliare. A causa della sua semplicità e rapidità, prevediamo che il sistema di espressione potenziato con p19 avrà valore nella produzione industriale, nonché uno strumento di ricerca per l’isolamento e la caratterizzazione biochimica di un’ampia gamma di proteine senza la necessità di rigenerazione dispendiosa in termini di tempo piante trasformate.

Vettori compatibili con il gateway per la genomica e la proteomica funzionale delle piante

La tecnologia di clonazione del gateway facilita la clonazione ad alto rendimento delle sequenze target utilizzando il sistema di ricombinazione sito-specifico del batteriofago lambda. Le sequenze bersaglio vengono prima catturate in un “vettore di ingresso” disponibile in commercio e vengono quindi ricombinate in vari “vettori di destinazione” per l’espressione in diversi organismi sperimentali.

La tecnologia gateway è stata adottata da numerosi laboratori di piante che hanno ingegnerizzato vettori di destinazione per analisi della specificità del promotore, studi di localizzazione delle proteine, studi di interazione proteina/proteina, studi di espressione proteica costitutiva o inducibile, knockdown genico per interferenza dell’RNA o esperimenti di purificazione dell’affinità. Esaminiamo i vari tipi di vettori di destinazione Gateway che sono attualmente disponibili per la comunità di ricerca sulle piante e forniamo collegamenti e riferimenti per consentire l’ottenimento di ulteriori informazioni su questi vettori.

Descriviamo anche una serie di vettori plasmidici “pEarleyGate” per la trasformazione vegetale mediata da Agrobacterium che fondono traslazionalmente tag epitopi di purificazione di affinità FLAG, HA, cMyc, AcV5 o tandem su proteine bersaglio, con o senza una proteina fluorescente adiacente. I tag dell’epitopo oligopeptidico consentono la purificazione per affinità, l’immunolocalizzazione o l’immunoprecipitazione di proteine ricombinanti espresse in vivo.

Dimostriamo l’utilità dei vettori di destinazione pEarleyGate per l’espressione di proteine etichettate con epitopi che possono essere catturate per affinità o localizzate mediante microscopia a immunofluorescenza. Gli anticorpi che rilevano i tag FLAG, HA, cMyc e AcV5 mostrano una reazione crociata relativamente ridotta con le proteine endogene in una varietà di piante monocotiledoni e dicotiledoni, suggerendo un’ampia utilità per i tag e i vettori.

Una nuova carbossipeptidasi correlata all’enzima di conversione dell’angiotensina (ACE2) converte l’angiotensina I in angiotensina 1-9.

ACE2, il primo omologo umano conosciuto dell’enzima di conversione dell’angiotensina (ACE), è stato identificato da 5 ‘sequenziamento di una libreria di cDNA ventricolare di insufficienza cardiaca umana. ACE2 ha un peptide segnale apparente, un singolo sito attivo di metalloproteasi e un dominio transmembrana.

I domini catalitici metalloproteasi di ACE2 e ACE sono identici al 42% e il confronto delle strutture genomiche indica che i due geni sono nati per duplicazione. In contrasto con il più onnipresente ACE, le trascrizioni ACE2 si trovano solo nel cuore, nei reni e nel testicolo di 23 tessuti umani esaminati. L’immunoistochimica mostra la proteina ACE2 prevalentemente nell’endotelio dei vasi coronarici e intrarenali e nell’epitelio tubulare renale. L’enzima ACE2 attivo viene secreto dalle cellule trasfettate mediante scissione N-terminale nel dominio transmembrana.

L’ACE2 ricombinante idrolizza la leucina carbossiterminale dall’angiotensina I per generare angiotensina 1-9, che viene convertita in peptidi di angiotensina più piccoli dall’ACE in vitro e dai cardiomiociti in coltura. ACE2 può anche scindere la bradichinina e la neurotensina des-Arg, ma non la bradichinina o altri 15 peptidi vasoattivi e ormonali testati. ACE2 non è inibito da lisinopril o captopril. L’espressione organo-specifica di ACE2 e la sua scissione unica di peptidi vasoattivi chiave suggeriscono un ruolo essenziale per ACE2 nel sistema locale renina-angiotensina del cuore e del rene.