L’esposizione alla calreticolina determina l’immunogenicità della morte delle cellule tumorali

Le cellule tumorali trattate con antracicline sono particolarmente efficaci nell’indurre una risposta immunitaria antitumorale, mentre altri agenti che danneggiano il DNA come l’etoposide e la mitomicina C non inducono la morte cellulare immunogenica. Qui vi mostriamo che le antracicline inducono la traslocazione rapida e preapoptotica della calreticolina (CRT) sulla superficie cellulare.

Il blocco o il knockdown del CRT ha soppresso la fagocitosi delle cellule tumorali trattate con antracicline da parte delle cellule dendritiche e ha abolito la loro immunogenicità nei topi. La traslocazione CRT indotta da antraciclina è stata imitata dall’inibizione del complesso della proteina fosfatasi 1 / GADD34. La somministrazione di CRT ricombinante o inibitori della proteina fosfatasi 1/GADD34 ha ripristinato l’immunogenicità della morte cellulare provocata dall’etoposide e dalla mitomicina C e ne ha potenziato gli effetti antitumorali in vivo. Questi dati identificano la CRT come una caratteristica chiave che determina le risposte immunitarie antitumorali e delineano una possibile strategia per la chemioterapia immunogenica.

La fibrosi cardiaca, associata a una ridotta estensione della microvascolarizzazione e all’interruzione delle normali strutture miocardiche, deriva da un’eccessiva deposizione di matrice extracellulare, mediata dal reclutamento di fibroblasti. La fonte di questi fibroblasti non è chiara e attualmente non sono disponibili terapie antifibrotiche specifiche.

Qui vi mostriamo che la fibrosi cardiaca è associata con l’emergere di fibroblasti provenienti da cellule endoteliali, suggerendo una transizione endoteliale-mesenchimale (EndMT) simile agli eventi che si verificano durante la formazione del cuscino atrioventricolare nel cuore embrionale.

Trasformare il fattore di crescita-beta1 (TGF-beta1) ha indotto le cellule endoteliali a subire EndMT, mentre la proteina morfogena ossea 7 (BMP-7) ha preservato il fenotipo endoteliale. La somministrazione sistemica di BMP-7 umano ricombinante (rhBMP-7) ha inibito significativamente EndMT e la progressione della fibrosi cardiaca nei modelli murini di sovraccarico di pressione e rigetto cronico dell’allotrapianto.

I nostri risultati mostrano che EndMT contribuisce alla progressione della fibrosi cardiaca e che rhBMP-7 può essere utilizzato per inibire EndMT e per intervenire nella progressione della cardiopatia cronica associata alla fibrosi.

La microscopia a forza atomica (AFM) a singola molecola è stata utilizzata per studiare le proprietà meccaniche della titina, la proteina sarcomerica gigante del muscolo striato. Le singole molecole di titina sono state allungate ripetutamente e la forza applicata è stata registrata in funzione dell’allungamento. A grandi estensioni, la forza di ripristino ha mostrato uno schema a dente di sega, con una periodicità che variava tra 25 e 28 nanometri.

Le misurazioni dei segmenti di immunoglobulina di titina ricombinante di due diverse lunghezze hanno mostrato lo stesso pattern e hanno consentito l’attribuzione delle discontinuità allo sviluppo dei singoli domini di immunoglobuline. Le forze richieste per dispiegare i singoli domini variavano da 150 a 300 piconewton e dipendevano dalla velocità di trazione. Dopo il rilassamento, è stato osservato il ripiegamento dei domini delle immunoglobuline.

Sono stati sviluppati diversi sistemi per consentire una purificazione rapida ed efficiente delle proteine ricombinanti espresse nei batteri. L’espressione di polipeptidi in frame con glutatione S-transferasi (GST) consente la purificazione delle proteine di fusione da estratti batterici grezzi in condizioni non denaturanti mediante cromatografia di affinità su glutatione agarosio (DB Smith e KS Johnson, 1988, Gene 67, 31-40) . Questo sistema di espressione vettoriale ha anche incorporato specifici siti di scissione della proteasi per facilitare la proteolisi delle proteine di fusione batterica.

Nelle nostre mani, la scissione di queste proteine di fusione in un sito di scissione della trombina procedeva lentamente. Per facilitare la scissione delle proteine di fusione, abbiamo introdotto un linker ricco di glicina (glicina kinker) contenente la sequenza P.G.I.S.G.G.G.G. situata immediatamente dopo il sito di scissione della trombina. Questo kinker della glicina aumenta notevolmente l’efficienza di scissione della trombina di diverse proteine di fusione. L’introduzione del kinker della glicina nelle proteine di fusione consente la scissione delle proteine di fusione mentre sono attaccate alla resina di affinità con conseguente purificazione in un’unica fase della proteina ricombinante.

Più di 2 mg della proteina altamente purificata sono stati ottenuti dall’equivalente di 100 ml di coltura batterica entro poche ore quando una proteina tirosina fosfatasi è stata impiegata come test proteico. Il vettore, pGEX-KG, è stato anche modificato per facilitare la clonazione di una varietà di cDNA in tutti i frame di lettura ed è stato utilizzato con successo per esprimere diverse proteine eucariotiche.

L’infezione da virus dell’epatite C cronica (HCV) si verifica in circa il 3% della popolazione mondiale ed è una delle principali cause di malattie del fegato. L’infezione da HCV è anche associata alla crioglobulinemia, una malattia proliferativa dei linfociti B. Il tropismo virale è controverso e i meccanismi di ingresso delle cellule rimangono sconosciuti.

La proteina E2 dell’involucro dell’HCV si lega al CD81 umano, una tetraspanina espressa su vari tipi cellulari, inclusi epatociti e linfociti B. Il legame di E2 è stato mappato al principale ciclo extracellulare di CD81. Le molecole ricombinanti contenenti questo HCV legato ad anello e gli anticorpi che neutralizzano l’infezione da HCV in vivo hanno inibito il legame del virus con il CD81 in vitro.