Embrioni di topo unicellulari sono stati infettati in vitro con vettori lentivirali ricombinanti per generare topi transgenici che trasportano il gene della proteina fluorescente verde (GFP) guidato da un promotore che esprime ubiquitariamente. L’80% dei topi fondatori portava almeno una copia del transgene e il 90% di questi esprimeva GFP a livelli elevati.
La progenie ha ereditato il transgene (i) e ha mostrato una fluorescenza verde. I topi generati utilizzando vettori lentivirali con promotori muscolo-specifici e specifici dei linfociti T hanno espresso livelli elevati di GFP solo nei tipi cellulari appropriati. Abbiamo anche generato ratti transgenici che esprimono GFP ad alti livelli, suggerendo che questa tecnica può essere utilizzata per produrre altre specie animali transgeniche.
Interazione di sostanze chimiche estrogeniche e fitoestrogeni con il recettore degli estrogeni beta
Il recettore degli estrogeni (ER) di ratto, topo e umano esiste come due sottotipi, ER alfa ed ER beta, che differiscono nel dominio di legame del ligando C-terminale e nel dominio di transattivazione N-terminale. In questo studio, abbiamo studiato l’attività estrogenica di sostanze chimiche ambientali e fitoestrogeni in saggi di legame alla competizione con la proteina ER alfa o ER beta e in un saggio di espressione genica transitoria utilizzando cellule in cui viene creata una risposta estrogenica acuta cotrasfettando colture con ER umano ricombinante DNA complementare alfa o ER beta (cDNA) in presenza di un plasmide reporter estrogeno-dipendente.
L’analisi di legame del ligando di saturazione della proteina ER alfa ed ER beta umana ha rivelato un singolo componente di legame per [3H] -17beta-estradiolo (E2) con alta affinità [costante di dissociazione (Kd) = 0,05 – 0,1 nM]. Tutte le sostanze chimiche estrogeniche ambientali [policlorodifenili, diclorodifeniltricloroetano (DDT) e derivati, alchilfenoli, bisfenolo A, metossicloro e clordecone] competono con E2 per legarsi a entrambi i sottotipi ER con una preferenza e un grado simili.
Nella maggior parte dei casi le affinità di legame relative (RBA) sono almeno 1000 volte inferiori a quelle di E2. Alcuni fitoestrogeni come coumestrol, genisteina, apigenina, naringenina e kaempferol competono più forte con E2 per legarsi a ER beta che a ER alfa. Sostanze chimiche estrogeniche, come ad esempio nonilfenolo, bisfenolo A, o, p’-DDT e 2′, 4′, 6′-tricloro-4-bifenilolo stimolano l’attività trascrizionale di ER alfa ed ER beta a concentrazioni di 100-1000 nM.
I fitoestrogeni, inclusi genisteina, coumestrolo e zearalenone, stimolano l’attività trascrizionale di entrambi i sottotipi di ER a concentrazioni di 1-10 nM. La classifica della potenza estrogenica dei fitoestrogeni per entrambi i sottotipi ER nel test di transattivazione è diversa; cioè, E2>>) zearalenone = coumestrolo> genisteina> daidzeina> apigenina = phloretin> biochanina A = kaempferol = naringenin> formononetina = ipriflavone = quercetina = chrysin per ER alfa e E2>>) genisteina = coumestrolo> zearalenone> daidze apigenina = kaempferol = naringenina> floretina = quercetina = ipriflavone = formononetina = crisina per ER beta.
Non è stato possibile rilevare l’attività antiestrogenica dei fitoestrogeni, ad eccezione dello zearalenone che è un agonista completo per ER alfa e un misto agonista-antagonista per ER beta. In sintesi, mentre la potenza estrogenica delle sostanze chimiche estrogeniche di derivazione industriale è molto limitata, la potenza estrogenica dei fitoestrogeni è significativa, specialmente per ER beta, e possono innescare molte delle risposte biologiche evocate dagli estrogeni fisiologici.
Isolamento efficiente dei geni mediante l’uso di sonde anticorpali.
Una tecnica sensibile e generale è stata ideata per il duplice scopo di clonare geni utilizzando anticorpi come sonde e isolando proteine sconosciute codificate dal DNA clonato. Il metodo utilizza un vettore di espressione, lambda gt11 (lac5 nin5 cI857 S100), che consente l’inserimento di DNA estraneo nel gene strutturale della beta-galattosidasi lacZ e promuove la sintesi di proteine ibride. Lo screening efficiente dei cloni produttori di antigeni nelle librerie di cDNA ricombinante lambda gt11 si ottiene attraverso la lisogenia della libreria dei fagi nelle cellule mutanti hflA (lisogenonia ad alta frequenza) di Escherichia coli; i lisogeno producono quantità rilevabili di antigene all’induzione, anche se piastrati a densità cellulari elevate.
Il vettore è anche progettato per facilitare l’isolamento delle proteine specificate da sequenze geniche precedentemente clonate. Le proteine ibride codificate dal fago ricombinante si accumulano in ceppi difettosi nella degradazione delle proteine (mutanti lon) in quantità suscettibili di purificazione su larga scala. Gli anticorpi prodotti contro la porzione dell’ibrido codificata dal DNA estraneo potrebbero a loro volta essere utilizzati per isolare il polipeptide nativo dalle cellule eucariotiche.
Effetto della terapia genica sulla funzione visiva nell’amaurosi congenita di Leber.
La distrofia retinica grave a esordio precoce causata da mutazioni nel gene che codifica per la proteina 65-kD specifica dell’epitelio del pigmento retinico (RPE65) è associata a scarsa visione alla nascita e completa perdita della vista nella prima età adulta.
Abbiamo somministrato a tre giovani pazienti adulti iniezioni subretiniche del vettore del virus adeno-associato ricombinante 2/2 che esprime il DNA complementare RPE65 (cDNA) sotto il controllo di un promotore RPE65 umano. Non ci furono dei seri eventi avversi. Non vi è stato alcun cambiamento clinicamente significativo nell’acuità visiva o nei campi visivi periferici sulla perimetria di Goldmann in nessuno dei tre pazienti.
Non abbiamo rilevato alcun cambiamento nelle risposte retiniche all’elettroretinografia. Un paziente ha avuto un miglioramento significativo della funzione visiva sulla microperimetria e sulla perimetria adattata al buio. Questo paziente ha anche mostrato un miglioramento in un test soggettivo di mobilità visiva. Questi risultati forniscono supporto per ulteriori studi clinici di questo approccio sperimentale in altri pazienti con RPE65 mutante. (Numero ClinicalTrials.gov, NCT00643747 [ClinicalTrials.gov].).
Effetti del prodotto del gene obeso sulla regolazione del peso corporeo nei topi ob / ob
I topi C57BL / 6J con una mutazione nel gene obeso (ob) sono obesi, diabetici e mostrano attività, metabolismo e temperatura corporea ridotti. L’iniezione intraperitoneale giornaliera di questi topi con proteina OB ricombinante ha abbassato il loro peso corporeo, la percentuale di grasso corporeo, l’assunzione di cibo e le concentrazioni sieriche di glucosio e insulina. Inoltre, il tasso metabolico, la temperatura corporea e i livelli di attività sono stati aumentati da questo trattamento. Ne
ssuno di questi parametri è stato alterato oltre il livello osservato nei controlli magri, suggerendo che la proteina OB ha normalizzato lo stato metabolico dei topi ob / ob.
Gli animali magri a cui è stata iniettata la proteina OB hanno mantenuto una minore perdita di peso durante lo studio di 28 giorni e non hanno mostrato cambiamenti in nessuno dei parametri metabolici. Questi dati suggeriscono che la proteina OB regola il peso corporeo e la deposizione di grasso attraverso effetti sul metabolismo e sull’appetito.
